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什么是NGS
NGS技術(shù)是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一項非常關(guān)鍵的技術(shù)。精準(zhǔn)診斷離不開分子診斷，而NGS技術(shù)是其中最難亦是應(yīng)用最廣的一項分子診斷技術(shù)。
由于NGS檢測具有很高的靈敏度，在NGS檢測過程中，樣本源性污染、Index源性污染、擴增產(chǎn)物污染以及氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽性或者假陰性的結(jié)果。因此，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對高通量測序?qū)嶒炇疫M行合理有效的分區(qū)規(guī)劃是至關(guān)重要的。
NGS實驗室的建設(shè)要點
NGS實驗室的面積
在建設(shè)NGS實驗室時需注意總體面積不宜過大，以免能耗消耗非常大。此外，在實驗室各區(qū)比例的設(shè)置上不要求平均比例，有的環(huán)節(jié)很小即可，有的環(huán)節(jié)可相對較大一些，即比例要合適。隨著醫(yī)院對NGS實驗室的支持力度越大，要求也越為嚴(yán)格，應(yīng)設(shè)置適當(dāng)?shù)姆块g數(shù)。
2.NGS實驗室的風(fēng)向
其一，NGS實驗室應(yīng)使用全新風(fēng)系統(tǒng)，而不能使用普通家用空調(diào)。新風(fēng)系統(tǒng)可排出污染，而這是防污染最基礎(chǔ)的設(shè)置。
其二，需注意整個房間的氣流方向應(yīng)形成對流才有效。
其三，目前出現(xiàn)問題較大的是生物安全柜、通風(fēng)柜和超凈工作臺這三種設(shè)備的合理配置使用。
NGS實驗室設(shè)計原則
各區(qū)獨立
實驗室各個區(qū)域無論是在物理空間上還是實際使用過程中，都應(yīng)當(dāng)處于完全分隔狀態(tài)，并且各區(qū)域之間不能有空氣的直接流通。
單一流向
NGS檢測通常涉及PCR擴增及核酸純化富集等過程，任何樣本源性污染、分析標(biāo)簽源性污染、擴增產(chǎn)物污染或氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，因此各實驗區(qū)域與緩沖間應(yīng)有一定的通風(fēng)壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染。
因地制宜
新建實驗室除合理規(guī)范外，也要易于管理;若原有實驗室通過合理的規(guī)劃改造也能滿足質(zhì)量管理要求，亦可不必特地新建實驗室。
便于工作
實驗室區(qū)域選擇及空間設(shè)計還應(yīng)最大限度考慮是否方便日常監(jiān)測工作，包括方便人員流動效率、大型儀器設(shè)備進出落地等。
NGS實驗室布局說明
試劑準(zhǔn)備區(qū)
本區(qū)應(yīng)為潔凈區(qū)域，用于配制試劑、儲存試劑及消耗品。若其他區(qū)污染通過空氣流入該區(qū)域內(nèi)，將影響后續(xù)操作流程和最終實驗結(jié)果，所以需獨立成區(qū)。此外，該區(qū)還需設(shè)置正負(fù)壓緩沖間，避免實驗室內(nèi)外空氣流通。后續(xù)各區(qū)域的緩沖間設(shè)置原則同該區(qū)一樣。
標(biāo)本制備區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA提取及其定量和濃度檢測。起始DNA模板的質(zhì)量和測序結(jié)果的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)，需嚴(yán)格遵循防污染要求，避免下游擴增產(chǎn)物對其污染。
若樣本為福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，還需設(shè)置標(biāo)本制備前區(qū)，用于標(biāo)本切片和HE染色。
3.打斷區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA片段化。人類基因組DNA長度過長，而NGS檢測的DNA片段范圍在200~300bp左右，所以在文庫制備前需要進行片段化處理，常用的有超聲打斷的物理方法。
若空間有限，可在標(biāo)本制備區(qū)專門劃分打斷區(qū)域，但需注意打斷后的樣本不在該區(qū)域開蓋轉(zhuǎn)管，以免污染其他DNA模板，同時做到定期清潔打斷區(qū)。
耗消耗非常大。此外，在實驗室各區(qū)比例的設(shè)置上不要求平均比例，有的環(huán)節(jié)很小即可，有的環(huán)節(jié)可相對較大一些，即比例要合適。隨著醫(yī)院對NGS實驗室的支持力度越大，要求也越為嚴(yán)格，應(yīng)設(shè)置適當(dāng)?shù)姆块g數(shù)。
4.文庫制備區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于構(gòu)建文庫。DNA經(jīng)片段化處理后產(chǎn)生粘性末端，需先修復(fù)補平為平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段兩端加上接頭和標(biāo)簽。若接頭或標(biāo)簽出現(xiàn)污染，導(dǎo)致樣本間數(shù)據(jù)錯分，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性也無法保證。
當(dāng)標(biāo)本量較少，且標(biāo)簽是通過DNA連接酶的非PCR反應(yīng)加上的，則標(biāo)本制備區(qū)和文庫制備區(qū)可合并。
5.擴增一區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫的預(yù)擴增和純化。文庫擴增涉及PCR過程，產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的氣溶膠，需獨立成區(qū)。
6.雜交捕獲區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于捕獲目的序列。
7.擴增二區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于對捕獲后的文庫進行擴增，同時對終文庫的濃度和片段大小進行檢測以及測序文庫的pooling工作。
8.測序區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫上機測序。房間溫度控制在18~22℃，2小時溫度波動應(yīng)小于2℃；濕度保持在20%~60%；避免人為引起的震動。
9.電泳區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于檢測提取后的DNA和超聲打斷后的DNA片段分析。
規(guī)劃好各功能區(qū)后，還需配備相應(yīng)的儀器設(shè)備，同時做上明確標(biāo)記，避免不同區(qū)域間的設(shè)備發(fā)生混淆，造成交叉污染。
NGS實驗室設(shè)計總結(jié)
NGS實驗室規(guī)范化布局的根本目的是為了提供物理上的阻隔，防止各區(qū)域間的交叉污染。在實際工作中，設(shè)計實驗室需要依據(jù)實際情況“量體裁衣”，以保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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